Douglas B. Rusch, Aaron L. Halpern, Granger Sutton, Karla B. Heidelberg, Shannon Williamson, Shibu Yooseph, Dongying Wu, Jonathan A. Eisen, Jeff M. Hoffman, Karin Remington, Karen Beeson, Bao Tran, Hamilton Smith, Holly Baden-Tillson, Clare Stewart, Joyce Thorpe, Jason Freeman, Cynthia Andrews-Pfannkoch, Joseph E. Venter, Kelvin Li, Saul Kravitz, John F. Heidelberg, Terry Utterback, Yu-Hui Rogers, Luisa I. Falco´n, Valeria Souza, Germa´n Bonilla-Rosso, Luis E. Eguiarte, David M. Karl, Shubha Sathyendranath, Trevor Platt, Eldredge Bermingham, Victor Gallardo, Giselle Tamayo-Castillo, Michael R. Ferrari, Robert L. Strausberg, Kenneth Nealson, Robert Friedman, Marvin Frazier, J. Craig Venter
The world’s oceans contain a complex mixture of micro-organisms that are for the most part, uncharacterized both genetically and biochemically. We report here a metagenomic study of the marine planktonic microbiota in which surface (mostly marine) water samples were analyzed as part of the Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition. These samples, collected across a several-thousand km transect from the North Atlantic through the Panama Canal and ending in the South Pacific yielded an extensive dataset consisting of 7.7 million sequencing reads (6.3 billion bp). Though a few major microbial clades dominate the planktonic marine niche, the dataset contains great diversity with 85% of the assembled sequence and 57% of the unassembled data being unique at a 98% sequence identity cutoff. Using the metadata associated with each sample and sequencing library, we developed new comparative genomic and assembly methods. One comparative genomic method, termed ‘‘fragment recruitment,’’ addressed questions of genome structure, evolution, and taxonomic or phylogenetic diversity, as well as the biochemical diversity of genes and gene families. A second method, termed ‘‘extreme assembly,’’ made possible the assembly and reconstruction of large segments of abundant but clearly nonclonal organisms. Within all abundant populations analyzed, we found extensive intra-ribotype diversity in several forms: (1) extensive sequence variation within orthologous regions throughout a given genome; despite coverage of individual ribotypes approaching 500-fold, most individual sequencing reads are unique; (2) numerous changes in gene content some with direct adaptive implications; and (3) hypervariable genomic islands that are too variable to assemble. The intra-ribotype diversity is organized into genetically isolated populations that have overlapping but independent distributions, implying distinct environmental preference. We present novel methods for measuring the genomic similarity between metagenomic samples and show how they may be grouped into several community types. Specific functional adaptations can be identified both within individual ribotypes and across the entire community, including proteorhodopsin spectral tuning and the presence or absence of the phosphate-binding gene PstS.
La expedición descrita en este artículo es impresionante por varias razones. Por una parte porque el área de muestreo es bastante grande, así como su distribución geográfica que abarca un transecto que conecta a dos océanos. Por otro lado, la cantidad de muestras y por lo tanto de secuencias de genes que obtuvieron es muy alta, lo que llevó a diseñar nuevos métodos que permitieran trabajar con tantos datos. Aún así, los investigadores tuvieron que reconocer que algunas de estas técnicas pueden ser mejoradas, incluso algunas de forma fácil, como es el caso de las quimeras que se forman al ensamblar las secuencias, ya que según se menciona, estos artefactos se pueden reconocer a simple vista.
ReplyDeleteLlama la atención que se identificara tan poca diversidad en las muestras. Y que al final se viera que diferentes ecotipos de una especie de bacteria puedan vivir, más o menos, separados formando subtipos plenamente reconocibles con las técnicas de metagenómica empleadas. Siendo esta la razón por la que se recurre a una explicación acerca de los factores que influyen en la conformación del nicho ecológico para entender estas diferencias de composición entre las comunidades.
Una cosa que no se menciona en el artículo es la posible influencia de las actividades humanas en la diversidad de especies encontrada. Si los viajes interoceánicos varias veces han tenido el efecto de homogeneizar la biodiversidad entre sitios diferentes, se esperaría que algo semejante pudiera ocurrir con las bacterias. Sin embargo, son más importantes los factores ambientales como la temperatura y la salinidad del océano. Además, las corrientes marinas tienen un papel en la delimitación geográfica de las poblaciones. De modo que, quizás, los viajes de las embarcaciones, incluso las de mayor tamaño, no tienen efectos significativos en la biodiversidad de los procariontes marinos.
En cuanto al diseño del muestreo, si se modificara, expresamente para encontrar mayor diversidad de especies, se podrían hacer muestreos a diferentes niveles de profundidad en el océano, ya que en este trabajo solamente se muestreó a unos cuantos metros de profundidad, por lo que algunas de las especies más frecuentes fueron organismos fotosintéticos. Probablemente, si se buscaran en mayores profundidades, se podría tener una perspectiva ecológica más completa, incluyendo a otros organismos diferentes a los productores primarios.
En otro sentido, el establecimiento del corte entre 97-98% para delimitar grupos taxonómicos, deja ciertas preguntas. Si se basan en el gen rRNA 16S, sólo sería viable identificar grupos con un nivel de confianza aceptable hasta el nivel de género, sin embargo, con los datos que se tienen, en ocasiones, se llegó a aceptar que había grupos diferentes pertenecientes a la misma especie, como diferentes ribotipos o filotipos. Por lo cual creo que esta aseveración se debe hacer con cautela, ya que los datos con los que se pueden comparar los resultados de la secuenciación muchas veces son insuficientes.
Luisa Sandner
ReplyDeleteThe Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Northwest Atlantic through Eastern Tropical Pacific
D. Rusch et al.
En este artículo los autores reportan los hallazgos de una expedición donde se tomaron muestras de la superficie del agua del océano para de allí obtener DNA para análisis metagenómico y con esos datos metagenómicos poder hacer inferencias en la composición, distribución, diversidad, abundancia, estructura genómica y evolución de las comunidades microbianas que habitan los océanos.
Obtuvieron 7.7 millones de “reads” secuenciados pero no todos se pudieron ensamblar en contigs más grandes, sólo un 9% de los “reads” se pudieron ensamblar en “scaffolds” más largos. Esto es un reflejo de la altísima diversidad genómica de la microbiota marina. Debido a este problema técnico, tuvieron que idear metodologías alternativas para poder obtener resultados de esta enorme base de datos metagenómicos. Ellos entonces compararon con Blast las secuencias sin ensamblar obtenidas del muestreo, a esto lo llamaron “fragment recruitment”. Con base a este método encontraron que sól el 30 % de las secuencias “reads” se alinearon con alguno de las 584 genomas que usaron de referencia. Este resultado indica que alrededor de 70% de las scuencias muestreadas con tienen homología con los genomas conocidos. Sólo genomas de 5 géneros bacterianos presentaron homología con estos fragmentos: Prochlorococcus, Synechococcus, Pelagibacter, Shewanella y Burkholderia. Estos 5 géneros representan el 50% de los fragmentos totales de secuencias “reclutadas” y solo el 15% del total de reads.
Los autores también encontraron una alta diversidad entre ribotipos (usando el 16s rRNA para detectar especies) y llegaron a la conclusión que la cantidad de variación que hay entre ribotipos (subtipos) hace pensar que ningún genoma de estas comunidades marinas es idéntico.
Un punto que a mi me pareció muy interesante es cómo pudieron identificar variaciones estructurales del genoma utilizando los datos metagenómicos con los fragmentos reclutados. Ellos encontraron gran cantidad de deleciones, inserciones, translocaciones e inversiones aunque la sintenia en general estaba muy conservada. La variación de la estructura de los genomas es un indicador potencial de cambios en las funciones, sobretodo si se pueden comparar las muestras oceánicas con las secuencias de microorganismos cultivables y también de la presencia de eventos de transferencia horizontal.
Compararon los datos entre los sitios de muestreo y encontraron correlaciones con el pH y la salinidad y entre sitios de clima tropical y clima templado. Esto nos hace pensar en que hay una estructura poblacional debida a las adaptaciones funcionales al clima, salinidad y nutrientes y no a la geografía solamente.
Alan Heres Rojas
ReplyDeleteThe Sorcerer IIGlobal Ocean Sampling Expedition: Northwest Atlantic through Eastern Tropical Pacific
Bajo la premisa de que los océanos son reservorios de una compleja mezcla de microorganismos y que la vasta mayoría de estos no están caracterizados tanto genética como bioquímicamente, se llevó a cabo un expedición de muestreo a través de algunos océanos del mundo (Global Ocean Sampling Expedition: GOS) esto a raíz del proyecto piloto de muestreo de Craig Venter en el mar de los Sargazos.
El estudio consistió de un análisis metagenómico de la microbiota planctónica marina. El muestreo se llevó acabo en un transecto de varios cientos de kilómetros desde el Atlántico Norte a través del canal de Panamá terminando en el Pacifico sur. El conjunto de datos obtenidos consistió de 7.7 millones de secuencias (6.3 billones de pb). Esta cantidad de información da una idea de la enorme diversidad y heterogeneidad de los sistemas marinos.
Este trabajo es de suma importancia desde el aspecto en el cual se genera nuevo conocimiento de la naturaleza de las comunidades microbianas de los oceanos, por ejemplo, su evolución y ecología, esto permitiría en primer término entender como la estructura de la microbiota marina impacta o influye en la dinámica global. Sin embargo, no hay que dejar de lado el hecho del personaje en cuestión, me refiero al señor Craig Venter, ya que sus intereses personales y esto a título personal, no radican solamente en la generación de nuevo conocimiento para la ciencia básica si no que busca obtener beneficios monetarios de su investigación y no es que considere que este mal que haya ciertas compensaciones monetarias producto del esfuerzo del trabajo, por ejemplo, él y su grupo impulsaron desde el sector privado la carrera por mapear el genoma humano, el problema no es ese en sí, sino que hizo el intento de patentar genes humanos para su posterior explotación.
Por otro lado, producto de sus investigaciones ha solicitado patentes en todo el mundo sobre lo que ha bautizado como “Micloplasma laboratorium” un organismo “sintético”. En palabras de grupos civiles en pro del raciocinio humano, señalan el comienzo de una guerra comercial de alto impacto para sintetizar y monopolizar formas de vida artificiales, por supuesto en pro del capitalismo. Considero absurdo pretender apropiarse de la naturaleza en sus múltiples formas ya que esta no le pertenece a nadie al contrario nosotros pertenecemos a ella siendo solo un componente más con la gran cualidad como seres humanos de entenderla, sin embargo, pareciera que solo pretendemos conquistar y dominarla.
Regresando al artículo, por supuesto no demerito la gran labor que implica este tipo de estudios, ya que son de gran complejidad debido a la enorme cantidad de información que se debe procesar. Sin embargo debido a lo ambicioso del proyecto existen una serie de errores técnicos en cuanto al diseño del estudio.
El artículo en cuestión pretende estudiar la diversidad bacteriana de los oceanos a lo largo del globo terráqueo. Para cumplir con este cometido, se recolectan muestras en distintos puntos del oceano pacífico y el Atlántico, dichas muestras son procesadas y secuenciadas en un intento por obtener metagenomas de los organismos que las componen.
ReplyDeletePara desconcierto de los autores, la cantidad de secuencias que logran ensamblar es llamativamente baja. Se encuentran con que la mayoría de las secuencias quedan como segmentos huérfanos. En esfuerzos por ensamblar el conjunto de segmentos, los autores implementan metodologías que llaman de ensamblaje extremo, donde restringen la similitud de los contigs para realizar el ensamble, y se valen también de genomas conocidos como guías. Aún con esto, se encuentran con secuencias que comparten una muy escasa identidad con lo ya conocido y les resulta practicamente imposible ensamblar más allá de lo que anteriormente habían logrado. Pese a esta serie de complicaciones, los autores analizan las secuencias por zonas geográficas y encuentran resultados interesantes. Entre ellos, descubren que pese a la gran predominancia de algunas especies bacterianas en todas las muestras, ciertos genes (ampliamente mecionado el de las proteorodopsinas) poseen una inmensa variación, e incluso al agruparlos por similitud encuentran que las secuencias de determinadas regiones geográficas, delimitadas por condiciones ambientales (temperatura del agua, principalmente), son más parecidas entre sí. Este resultado coincide con lo encontrado al hacer análisis de abundancia con los distintos ribotipos secuenciados, dónde también es notable una separación de las bacterias de acuerdo con distintas regiones geográficas.
El extenso trabajo dirgido por Venter, tiene varios aspectos criticables. Entre los más importantes, desde mi punto personal de vista, se encuentra la toma de muestras. La cobertura del muestreo es amplia si se piensa en dos dimensiones, sin embargo al pensar en tres dimensiones es posible percatarse de que hace falta un muestreo que considere las distintas profundidades a las que es posible extraer microorganismos. Es sumamente simplista tomar como absoluta una muestra que no incluye distintas profundidades, y es posible que en la información sesgada por este tipo de muestreo existan datos sumamente interesantes sobre la ecología microbiana marina. Por otra parte, la serie de filtros utilizados por el grupo también sesga la muestra hacia una cantidad moderada de microbios, problema que sería de gran impacto si se quisieran establecer redes de interacciones, ya que el sesgo en la muestra podría opacar interacciones de importancia para la ecología del sistema.
Otro punto a discutir es el porqué el grupo fue incapaz de ensamblar las secuencias. Una de las razones pareciera ser la cantidad de genomas disponibles como referencias, si bien la cantidad de organismos secuenciados es grande y cada día incrementa, este montón de información queda lejos de representar la diversidad total de microorganismos, es más bien el triste 1% que ha sido posible aislar y cultivar. Quizá si se contara con una mayor diversidad de genomas de referencia, el ensamblaje de metagenomas tan ambiciosos como el que realizó Venter no resultaría un proceso tan tortuoso. De modo que uno puede plantearse ¿es realmente útil realizar metagenomas? o bien ¿es realmente indispensable tener más genomas de referencia para poder extraer la mayor cantidad de información de un metagenoma? En este artículo es aparente que antes de aventurarse al complicado universo de la metagenómica es vital cerrar el agujero de incertidumbre que se tiene entre los genomas de referencia por la escasa diversidad de organismos que ha sido posible aislar. Si bien es impensable aislar y secuenciar el total de la diversidad microbiana, es vital sobrepasar ese insuficiente 1%, ya que esto podría representar el puente de información faltante para poder explotar el grandísimo potencial de la metagenómica.
Alejandra Hernández Terán
ReplyDeleteThe Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Northwest Atlantic through Eastern Tropical Pacific
La expedición GOS, Global Ocean Sampling es un proyecto metagenómico en el que se pretende entender un poco sobre el rol de los microorganismos marinos mediante técnicas moleculares. El artículo comienza con la introducción de que el concepto de diversidad microbiana no está desarrollado del todo, ya que este puede entenderse de diversas formas; genética, ya sea taxonómica o filogenéticamente, la cual es normalmente utilizada en los métodos moleculares, o bioquímica-fisiológica, usada más en técnicas de cultivo. Además de esto abordan también el concepto de especie en este sentido, el cual está dado por determinado porcentaje de similitud en secuencias y que podría incluir cambios funcionales y/o morfológicos que no se contemplan al incluir organismos dentro de una misma especie.
Se realizó un experimento que consistió en la toma de muestras en 41 sitios diferentes, de cada sitio se filtraron alrededor de 200L con tamaños de filtro diferentes, para la extracción de DNA se tomó el del 0,1 um de modo que se incluyeran Bacteria y Archaea. Se realizaron librerías de clonas de cada muestra las cuales se intentaron ensamblar, de estos, el 53 de las lecturas no lograron ser ensambladas. Mencionan que la cantidad y la distribución de las lecturas de cualquier genoma dado es un indicador de la abundancia de sus parientes cercanos. Sólo los genomas de cinco géneros: Prochlorococcus, Synechococcus, Pelagibacter, Shewanella y Burkholderia, produjeron un reclutamiento sustancial de los fragmentos sobre la mayor parte del genoma de referencia. Interesantemente, dentro de estos géneros se incluyen muchos genomas de referencia, y se observaron diferencias significativas en los patrones de reclutamiento, incluso entre organismos de la misma especie, lo cual podría deberse a pérdida de genes por encontrarse en ambientes con condiciones diferentes, es decir, una especiación a menor escala que se le denomina ecotipos, ya que representan a la misma especie, pero que por presiones ambientales desarrollan cambios en el genotipo que pueden verse expresado en cambios también en el fenotipo.
Uno de los aspectos más importantes del artículo, mas allá del hecho de que no hayan logrado ensamblar la cantidad de genomas que tenían previsto, es que arroja el panorama de la inmensa diversidad tanto funcional como a nivel ecotipo que existe en los ambientes oceánicos, y que debido a la cantidad de recursos económicos necesarios para llevar a cabo un proyecto así no se había podido realizar. Aunque creo que lo que sigue es un estudio que se enfoque más a fondo en la escala temporal del cambio, en condiciones ambientales especificas, este proyecto es sin duda un parteaguas para lograrlo.