Jennifer C. Stearns, Michael D. J. Lynch1, Dilani B. Senadheera, Howard C. Tenenbaum, Michael B. Goldberg, Dennis G. Cvitkovitch, Kenneth Croitoru, Gabriel Moreno-Hagelsieb & Josh D. Neufeld
We present bacterial biogeography as sampled from the human gastrointestinal tract of four healthy subjects. This study generated .32 million paired-end sequences of bacterial 16S rRNA genes (V3 region) representing .95,000 unique operational taxonomic units (OTUs; 97% similarity clusters), with .99% Good’s coverage for all samples. The highest OTU richness and phylogenetic diversity was found in the mouth samples. The microbial communities of multiple biopsy sites within the colon were highly similar within individuals and largely distinct from those in stool. Within an individual, OTU overlap among broad site definitions (mouth, stomach/duodenum, colon and stool) ranged from 32–110 OTUs, 25 of which were common to all individuals and included OTUs affiliated with Faecalibacterium prasnitzii and the TM7 phylum. This first comprehensive characterization of the abundant and rare microflora found along the healthy human digestive tract represents essential groundwork to investigate further how the human microbiome relates to health and disease.
Luisa Sandner
ReplyDeleteBacterial biogeography of the human digestive tract
J. Stearns et al.
Los métodos independientes dl cultivo, como las secuenciación del 16s rRNA y la metagenómica han revelado una diversidad microbiana no esperada en sitios como la boca y el estómago (sin olvidar la enorme diversidad encontrada en el medio ambiente como mares, tierra etc.). Este trabajo tiene como finalidad caracterizar con estos métodos la comunidad microbiana del tracto digestivo humano lo cual es importante para entender y predecir las alteraciones de estas comunidades a la luz de las enfermedades. Para este estudio ellos utilizaron 4 individuos sanos y tomaron muestras a lo largo de todo el tracto digestivo: boca, estómago, duodeno, colon, recto y heces. De las muestras bacterianas amplificaron la región V3 del 16s rRNA.
Resultados relevantes:
Encontraron que las comunidades bacterianas se agrupan de acuerdo al sitio de muestreo. Estimados de diversidad de Shannon dieron que la mayor diversidad está en las muestras de la boca y la menor diversidad en el estómago. Entre individuos la diversidad filogenética mayor fue la de la boca y la menor en heces y estómago.
Características taxonómicas: se encontraron secuencias a las que no se les pudo asignar un género, por lo que podemos concluir que hay bacterias de nuevos linajes en el microbioma humano. Encontraron 19 phyla en la boca, siendo los más predominantes Actinobacteria, Bateroidetes, Firmicutes, Fusobacteria, Proteobacteria y Spirochaetes. En la boca fue donde se encontró la mayor similitud filogenética de microbiomas entre sujetos , que coincide con el mismo resultado del artículo del microbioma humano. En el estómago y duodeno, se encontaron menos OTUs que en otros sitios, pero aún así presentaron representantes de la mayoría de las phyla, aunque en menor abundancia. El índice de Shannon no reflejó esta diversidad que si se captó con la secuenciación. Firmicutes y Bacteroidetes predominó en la mucosa del colon. Firmicutes y Actinobacteria en las muestras de heces.
Las muestras se agruparon según el sitio del tracto digestivo (UniFrac), queriendo decir esto que cada región tiene una estructura comunitaria específica. Usando diagramas de Venn se demostró que existen sobrelapes de OTUs entre las zonas muestreadas, donde las muestras del colon y de las heces con las que más se sobrelapan.
Como conclusión se puede decir que el microbioma del tracto digestivo varía a lo largo del mismo y que es de suma importancia conocer su biogeografía porque es en la cavidad oral y en el tracto digestivo donde se dan interacciones íntimas entre las comunidades bacterianas y las células humanas.
Alan Heres Rojas
ReplyDeleteBacterial biogeography of the human digestive trac
En estudios previos ya se había revelado una la diversidad microbiana en sitios tales como la boca y el estómago, sin embargo, los estudios que han utilizado las nuevas tecnologías de secuenciación han permitido tener mayor cobertura de las poblaciones asociadas a múltiples zonas del cuerpo humano, en particular a la cavidad oral y el tracto digestivo, estos análisis revelaron una alta diversidad sitio-específica de la composición de la comunidad microbiana, además, dicha composición es única para cada individuo. Sin embargo, no se conocía la microbiota asociada al sistema digestivo humano completo (boca-ano) en individuos saludables.
La caracterización de la comunidad microbiana asociada al tracto digestivo es crucial, por ejemplo, las alteraciones de esta comunidad podrían tener relación o estar asociadas a ciertas enfermedades, por ello el propósito de este trabajo fue caracterizar la estructura y composición de la microbiota a través del tracto digestivo humano, para lo cual los autores hacen el estudio en cuatro sujetos “saludables” (es importante señalar que este trabajo no corresponde al Proyecto del Microbioma Humano por tal motivo los recursos supongo fueron más limitados, señalo esto para argumentar a favor del porqué de solo 4 individuos ya que en el artículo no lo señalan), implementando un enfoque metagenómico, es decir, la composición de la microbiota se determinó mediante la secuenciación del gen 16S rRNA específicamente la región hípervariable V3, la cual supongo permitió una alta calidad de cobertura (mayor al 99% para la mayoría de las muestras).
Obtuvieron 32770833 secuencias ensambladas con una longitud promedio de 149.3 ±10.9 pb. El análisis de identidad con un corte al 97% produjo 97252 OTUs de los cuales 56910 (0.17% de las secuencias) fueron secuencias únicas con una cobertura con alta con un promedio de .996 para todas las muestras.
La estimación del índice de diversidad de Shannon revelo que la zona de la boca es la zona más diversa, mientras que el estómago la menos diversa, el colon y las heces fueron muestras altamente variables. Por otro lado, la diversidad filogenética de la boca fue significativamente mayor y mucho más consistente entre los individuos muestreados, a diferencia de cualquier otra zona probada o muestreada. Otro resultado importante fue que de las secuencias colectadas el 0.63% y el 10.83% no pudieron ser asignadas a un filum o género. Lo cual indicaría que el conjunto de secuencias del gen 16S rRNA obtenidas podrían ser potencialmente nuevos linajes en el microbioma humano.
En el caso de la boca se encontraron 19 filum presentes en los 4 individuos muestreados con la predominancia de 5 o 6 filum; Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Fusobacteria, Proteobacteria y secuencias parecidas a Espiroquetas, TM7 o SR1.
Alejandra Hernández Terán
ReplyDeleteBacterial biogeography of the human digestive tract
Stearns, 2011
La diversidad de las comunidades microbianas que se encuentran dentro del cuerpo humano está intimamente ligada con aspectos fisiológicos y metabólicos, asì como funcionales que incluyen maduración del sistema inmunológico, balance de energía, susceptibilidad a enfermedades y el comportamiento del hospedero. Debido a que estos microorganismos juegan un papel muy importante en la regulaciòn de procesos relacionados con enfermedades en los humanos, caracterizar las comunidades microbianas asociadas al tracto humano es un prerequisito para entender y predecir cómo las alteraciones en estas comunidades se relacionan con las enfermedades. Por medio de Illumina se secuenció el gen 16S de las poblaciones de bacterias presentes en muestras orales y gastrointestinales de cuatro individuos sanos, dos mujeres y dos hombres, en los que los resultados muestran que las poblaciones de muestras similares se agrupan juntas y que grupos de bacterias diferentes son característicos de diferentes sitios en el cuerpo humano.
Una de las cosas que me pareció más importante fue que ellos realizan un protocolo de validación para la secuenciación en Illumina, el cual consiste en secuenciar una comunidad definida de 12 especies conocidas por el método de Sanger, para ver si la plataforma arrojaba los mismos resultados. Contrario a lo que se esperaba, se encontraron pocas secuencias de Pseudomonas en la muestra, y aunque con el método de Sanger no había salido ninguna se esperaba que por ser una plataforma más fina detectara más. Esto es importante ya que siguiendo el ejemplo, al quedarse con un sólo método se crea un sesgo propio del alcance del mismo, resaltando la importancia de aumentar la cobertura evitando la pérdida de OTUs por problemas metodológicos.
Otra cosa que me parece interesante es que contrario al artículo anterior de Structure, function and diversity of the healthy human microbiome, las muestras de las heces no se separan de las demás en un cluster diferente, sino que el sitio que guarda mayor diferencia es el estómago, el cual es el que menos OTUs comparte con los demás sitios y que además su composición no es homogénea entre organismos. Resalta el hecho además de que pocas Enterobacterias fueron encontradas, contrario a lo que pensaría por ser organismos representativos del tracto intestinal. En cuanto a diversidad también me llama la atención el dato de que las especies más constantes son las pertenecientes a Clostridiales, organismos que son anaerobios obligados y que por lo tanto se podría pensar que estos pudieran estar interactuando en biofilms dentro del cuerpo humano, logrando así las condiciones anoxigénicas necesarias para su desarrollo. Por último, concluyo que trabajos de este tipo son necesarios para conocer cómo se compone la microbiota de organismos sanos y posteriormente compararla con las de individuos que presenten enfermedades y de esta manera poder llegar a un conocimiento más amplio de cómo estos microorganismos influyen directamente en los procesos de salud-enfermedad en humanos.
Este artículo se vale del potencial de la secuenciación masiva para realizar un estudio de que se propone caracterizar la microbiota presente a lo largo del tracto digestivo del humano sano. Los autores obtienen muestras de distintos niveles reelevantes -boca, estómago, duodeno, colon transverso y descendente, recto, y heces- del tubo digestivo de dos hombres y dos mujeres. De las muestras extraen DNA y secuencian la fracción variable 3 del RNA ribosomal 16S.
ReplyDeletePese a que el número de individuos muestreados no es grande, el estudio revela resultados consistentes y sumamente interesantes. Primero que nada encuentran que la diversidad alfa es mayor a la diversidad beta, lo que podría reflejar la fisiología del microbioma: pese a que en resultados posteriores encuentran que la combinación de microorganismos no es idéntica entre los individuos, el índice de Shannon quizá nos hable sobre un agrupamiento funcional que se mantiene constante entre los individuos. Esta suposición se refuerza con un análisis de coordenadas principales, donde el equipo muestra que los taxa bacterianos unicamente se agrupan con respecto al lugar de muestreo y no con respecto a otras variables como individuo o género.
Una pregunta interesante a responder es si la microbiota de un ecosistema en específico es única o si se comparte con otros y en qué magnitud; siendo en tracto disgestivo un tubo continuo donde la materia fluye de forma constante de un nivel a otro es posible pensar que los distintos sitios pueden compartir una enorme cantidad de bacterias. Sin embargo hay que recordar que no es lo mismo migrar que asentarse y que el tracto digestivo si bien es físicamente continuo, tiene fronteras delimitadas por factores ambientales como el pH y la disponibilidad de nutrientes, por lo que un organismo que puede sobrevivir en el colón no lo hará tan bien en el estómago o en la boca, por ejemplo. Así lo demuestran en el artículo con diagrammas de Venn, donde observan que existen microbios compartidos entre todos los sitios, así como sólo compartidos entre algunos de ellos, y también únicos de cada sitio muestreado. Es interesante notar la disminución en el número de organismos al pasar de la boca al estómago, efecto que es igualmente notable en su análisis de abundancias. Pareciera que el estómago es una suerte de filtro (químico tal vez) que restringe a los microorganismos que poblarán el resto del tubo.
Por último, el grupo analiza bacterias específicas de interés médico. En este análisis encuentra presencia de varios patógenos, pero resalta que su abundancia es escasa; en cambio organismos benéficos como Faecaelibacterium prausnitzii se encuentran en mayor cantidad. En este último análisis salta a la vista que en ell individuo dos, en el que F. prausnitzii es menos abundante en el colon, Treponema denticola se ecuentra en grandes cantidades en la boca, contrastando con los otros tres sujetos de estudio. Como una hipótesis muy atravancada se podría decir que ambas bacterias interactúan de algún modo en la boca y que esta interacción determina la presencia de F. prausnitzii en el colon.
El estudio realizado por el grupo de Neufeld es de gran reelevancia para el estudio del microbioma humano, si bien el acercamiento experimental se limitó unicamente a estudios taxonómicos. Hubiese sido muy interesante complementar los resultados taxonómicos con un análisis metagenómico, ya que éste podría aclarar dudas sobre la función del microbioma que con el estudio del 16S quedan aún como meras hipótesis.
En este artículo se describe la investigación del microbioma del tracto digestivo de humanos adultos sanos. Participaron cuatro voluntarios, dos hombres y dos mujeres, a quienes se les tomaron muestras de la boca, el estómago, el duodeno, el colón, el recto y las heces. Parece una muestra pequeña de individuos, pero esto se debe a que las técnicas de gastroscopía y colonoscopía son más complejas y caras, por lo que no se pueden aplicar masivamente a una amplia muestra de voluntarios, por lo que se privilegió tomar muestras completas de calidad aunque fueran pocas.
ReplyDeleteDe las muestras obtenidas de los hospederos humanos se amplificó y secuenció con el método de Illumina el fragmento V3 del gen rRNA 16S. Se obtuvieron millones de secuencias, que se fueron “filtrando” hasta quedarse con las secuencias correspondientes a 92,252 OTUs. Los fragmentos de secuencias usados fueron de aproximadamente 150 pares de bases, y se usaron para determinar a qué grupos taxonómicos correspondían las especies de bacterias. También se comparó el método de secuenciación de nueva generación utilizado con la secuenciación Sanger, concluyendo que es eficiente y reproducible, aunque en el caso de la secuenciación Sanger se obtuvo una proporción menor que la esperada de Pseudomonas.
Mediante un análisis de coordinados principales (PCoA) se determinó que el principal factor que agrupó a las OTUs fue el sitio donde se muestrearon. Además gráficamente se observa que las agrupaciones de bacterias determinadas por el PCoA se suceden unas a otras en el mismo orden en el que se encontrarían en el tubo digestivo, es decir, las de la boca aparecen cerca de las bacterias del estómago, éstas de las del duodeno, seguidas por las del colón, a las cuales se hallan próximas las de las heces.
La diversidad de especies de bacterias resultó semejante entre los individuos muestreados. El sitio con mayor parecido entre los cuatro voluntarios fue la boca, y en segundo lugar el colón. Los más variables fueron el estómago y el duodeno. Los phyla determinados fueron los mismos, pero la diversidad y dominancia de cada uno fue variable entre los individuos.
Debido a la limitante de sólo haber amplificado y secuenciado el fragmento V3 del rRNA 16S no se pudo determinar qué procesos fisiológicos realizan las bacterias en el sitio donde viven, por lo tanto, se desconoce aún de qué funciones dependen las comunidades de bacterias. Sin embargo, por inferencia a partir de los phyla determinados se supuso cuáles eran las funciones realizadas por las bacterias. Las funciones de los taxones raros se infirieron también de la misma manera. Así los investigadores se dieron cuenta de que las funciones de los taxones raros serían redundantes con las de los taxones dominantes. De esto se podría concluir que los taxones raros no son importantes ecológicamente, sólo tendrían importancia en cuanto a la riqueza de especies de los sitios del tracto digestivo.
Aunque esta investigación tuvo limitaciones, como contar con una cantidad pequeña de voluntarios para la obtención de las muestras y usar sólo un fragmento del gen rRNA 16S para determinar la identidad de las especies de bacterias o al menos a qué taxón superior correspondían, así como qué funciones realizan en la comunidad microbiana, a nivel personal me parece que tiene puntos positivos al haber hecho muestreos lo más íntegros que fuera posible para tener un panorama general completo del microbioma de todos los sitios del tubo digestivo humano.